双萤光素酶报告基因检测(DualLuciferaseReporterAssay)广泛应用于启动子活性分析、转录因子调控研究、miRNA靶向验证等实验。然而,由于实验流程复杂,涉及载体构建、细胞转染、裂解检测等多个环节,容易出现各种问题。本文将系统梳理常见失败原因及解决方案,帮助大家高效完成实验。
01 发光值过高或过低
1.发光值过高
样品本身发光值高:发光值过高可能会超出仪器检测范围,从而检测不到值,一般读数在5-6位之间较好。
解决方案:
a.减少质粒转染量;
b.细胞样品裂解后,离心取上清后对裂解产物进行稀释后检测。
2.发光值过低
1)转染效率太低:报告基因质粒无法成功进入细胞或较少进入细胞,会导致检测出的发光值较低。
解决方案:
a. 优化转染条件,用较易转染的质粒做阳性对照(如转染过表达萤光蛋白质粒);
b. 确保转染DNA的质量,可通过酶切或琼脂糖凝胶电泳的方法对DNA质量进行鉴定;
c. 选择状态较好,处于对数分裂期的细胞进行转染;
d. 选择合适的转染试剂。
2)载体选择不当:萤火虫萤光素酶载体启动子活性不足,导致信号过低;海肾萤光素酶(RenillaLuciferase)使用强启动子(如CMV/SV40),干扰主报告基因检测。
解决方案:
a.萤火虫萤光素酶:推荐使用pGL3、pGL4或pmirGLO载体,确保启动子活性。
b. 海肾萤光素酶:建议选用phRLTK或pGL4载体,采用中等强度启动子(如TK)。
3)载体比例失衡:萤火虫与海肾萤光素酶质粒比例不当,导致内参信号过高或过低。
解决方案:
预实验优化比例,确保表达后的萤火虫萤光素酶信号显著高于海肾萤光素酶信号。
4)裂解不充分:细胞裂解不完全,萤光素酶未充分释放。
解决方案:
a.裂解液足量,冰上裂解5-10min,可适当吹打,确保细胞完全破碎。
细胞培养时间不宜过长,12-36h内最好,长时间培养后,细胞可能会难裂解。
5)检测过程操作不规范:不规范的检测条件也有可能使得读值偏低。
解决方案:
a. 需加入足量底物,保证底物饱和,否则会造成结果偏差;
b. 室温反应,反应时各个组分(细胞裂解产物,底物工作液等)都需要调整到室温;
c. 加完底物后可立即检测,萤光素酶的半衰期一般约30min,尽量在30min内完成,否则读值会偏小。
6)底物氧化失效:无法正常进行反应。
解决方案:
a. 底物避光密封保存,萤火虫荧光素酶底物-20℃保存,海肾荧光素酶底物推荐-80℃保存;
b. 反应工作液现用现配。
02 不同复孔发光值差异大
1.样本均一性不好:
由于操作误差导致每孔细胞数不一致、细胞状态差异等,导致每孔检测结果差异较大。
解决方案:
a. 细胞裂解后建议离心取上清,保证样本的均一性;
b. 移液器需定期校准,确保移液精准;
c. 接种细胞时严格进行细胞计数;
d. 避免气泡出现。
注:荧光素酶报告基因实验的检测结果非常灵敏,复孔之间的数值有一定差异是正常的,一般认为在同一个数量级的差异是可以接受的。
双萤光素酶实验结果的好坏取决于载体设计、转染效率、裂解条件、检测方法等等。通过优化实验流程,并选择高稳定性检测系统,即可显著提升检测成功率。
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